高效液相色谱法同时检测黄酒中的5-羟甲基糠醛和9种多酚首席医学网 2010年03月02日 11:26:26 Tuesday 作者:陈磊 黄雪松* 作者单位:暨南大学食品科学与工程系,广州 510632 [摘要] 建立了黄酒中5-羟甲基糠醛和9种多酚(儿茶素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、阿魏酸、p-香豆酸)的高效液相色谱检测方法。采用Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)分离,柱温为42 ℃,检测波长为280 nm,流动相为乙腈和3%乙酸水溶液,梯度洗脱,20 min内10种物质得到了较好的分离。各化合物回归方程的相关系数r为0.9911~0.9995,检出限为0.2~0.5 mg/L; 相对标准偏差RSD≤2.4 %; 10种组分的平均回收率为89.4%~98.3%; 能够满足定量分析要求。实验结果表明,本方法适用于不同种类和年份黄酒中5-羟甲基糠醛和9种多酚的检测。[关键词] 糠醛;多酚;反相高效液相色谱;黄酒 Simultaneous Determination of 5-Hydroxymethylfurfural and Nine Kinds of Phenolic Compounds in Rice Wine Using High Performance Liquid ChromatographyCHEN Lei,HUANG Xue-Song*(Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632)Abstract An analytical method of reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was developed for simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural and nine phenolic compounds(including (+)-catechin,(-)-epicatechin,chlorogenic acid,rutin,caffeic acid,protocatechuic acid,syringic acid,ferulic acid and p-coumaric acid) in 20 min.Ten components were detected and separated successfully by Diamonsil C18 column (150 mm×4.6 mm,5 μm) at wavelength of 280 nm and column temperature of 42 ℃,with acetonitrile and 3% acetic acid solution as the mobile phase in gradient elution.The resultant correlation coefficients of the ten compounds were between 0.9911 and 0.9995 with detection limit from 0.2 to 0.5 mg/L,the RSD less than 2.4% and the average recoveries from 89.4% to 98.3%.These experimental results demonstrate that 5-hydroxymethylfurfural and the nine phenolic compounds in different rice wine samples can be determined with the new method for practical uses.Keywords Hydroxymethylfurfural;Polyphenol;Reversed phase high performance liquid chromatography;Rice wine1 引言黄酒(Rice wine)是我国的特产,历史悠久,含有丰富的营养素与多种活性物质,具有饮用、调味、药用、保健等作用。黄酒的这些作用与其所含有的化学成分(如糊精、有机酸、氨基酸、活性肽、维生素、多酚、微量芳香成分等)密切相关[1,2]。其中,多酚是黄酒调味、药用、保健等作用的基础物质,但黄酒中的多酚常难以准确测定。5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural,HMF)作为一种Maillard反应的重要产物,不仅是引起食品风味和褐变的指标成分,而且具有多方面的生理作用 [3~5],受到广泛关注。因此,检测农产品及其加工食品中的多酚和HMF,对于正确评价食品原料及其制品的保健作用和品质具有重要意义。目前,高效液相色谱检测单体多酚类物质已有很多报道,但主要集中于检测酚酸类与黄酮类物质方面[6~11]。由于两类多酚的性质差异较大,难以同时测定。若在变波长条件下同时检测HMF和多酚,则需要二极管阵列检测器,而且耗时长[12]。将HMF与多酚类物质以高效液相色谱法同时检测还未见报道。本研究采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)同时检测黄酒中HMF和上述两类多酚中9种常见的代表性酚类物质,并测定不同品牌不同年份的黄酒样品中多酚和HMF的含量,为不同年份的酒质提供评价依据。2 实验部分2.1 仪器、原料与试剂LC-20AT高效液相色谱仪,配备SPD-M20A光电二极管阵列检测器(DAD,日本岛津公司);Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,美国迪马公司);SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);溶剂过滤器和0.45 μm微孔滤膜(天津津腾试验设备有限公司)。黄酒:从浙江各公司购得目前市场销售量大的两个品牌(分别记为品牌I、品牌II)3年陈、5年陈、8年陈、10年陈酒样,用于测定其HMF和多酚的含量。(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素(上海同田生化技术有限公司);阿魏酸(中国医药(集团)上海化学试剂公司);绿原酸(中国药品生物制品鉴定所);5-羟甲基糠醛、芦丁、咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、p-香豆酸(Sigma公司); 乙腈(HPLC级,美国DIKMA公司); 冰乙酸(分析纯,天津市化学试剂一厂)。实验用水为二次蒸馏水。2.2 色谱条件Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);检测温度:42 ℃;检测波长:280 nm;进样量:10 μL;流动相:乙腈,3%乙酸水溶液,梯度洗脱程序见表1。表1 HPLC梯度洗脱程序(略)Table 1 Gradient eluted program of HPLC2.3 标准溶液及样品溶液的配制准确称取标准品5-羟甲基糠醛、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、芦丁、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸各约10.0 mg,分别用乙腈定容至10 mL,得到每个标准品的标准溶液。分别移取1.0 mL HMF、阿魏酸、丁香酸、p-香豆酸标准溶液和2.0 mL(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、芦丁、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸标准溶液,用流动相(V(3%乙酸水溶液)∶V(乙腈)=8∶2)定容至50 mL,得多酚混合标准贮备液,使用时用流动相稀释成不同浓度梯度的标准溶液。取不同品牌各年份的黄酒用0.45 μm微孔滤膜过滤,供HPLC检测。2.4 分析方法的评价2.4.1 标准曲线 准确移取混合标准溶液各0.5, 1.0, 2.0, 4.0和8.0 mL,分别定容至10 mL,每个浓度重复进样3次,以各单体酚的平均峰面积与标准溶液中物质的含量作校准曲线,并计算相关系数。2.4.2 检出限和精密度的测定 将一定质量浓度的标准溶液逐级稀释,进样。当信噪比等于3时,所对应的标准溶液中所含组分的质量为检出限。将某一浓度的标准溶液重复进样5次,根据结果计算相对标准偏差。 3 结果与讨论3.1 检测波长的确定通过二极管阵列检测器(DAD)扫描得到各物质在紫外光区的最大吸收波长(图1),为了能同时测定这几种物质,同时又避开溶剂的吸收,检测波长确定为280 nm。图1 10种物质的紫外光谱图(略)Fig.1 Ultraviolet spectrogram of 10 componentsa.5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural,HMF);b.原儿茶酸(Protocatechuic acid);c.(+)-儿茶素((+)-Catechin);d.绿原酸(Chlorogenic acid);e.咖啡酸(Caffeic acid);f.(-)-表儿茶素 ((-)-Epicatechin);g.丁香酸(Syringic acid);h.p-香豆酸(p-Coumaric acid);i.芦丁 (Rutin); j.阿魏酸(Ferulic acid)。3.2 色谱条件的优化3.2.1 流动相及洗脱比例和流速 考察了0.5%乙酸水溶液-乙腈、2%乙酸水溶液-乙腈和3%乙酸水溶液-乙腈作流动相时的分离效果。结果显示,随乙酸含量的增加,峰形和分离效果变好。考虑到pH太低会损坏色谱柱而导致柱效降低,而且会使基线严重漂移,故选定3%乙酸溶液和乙腈为流动相。通过调整流动相的比例发现,使用线性梯度洗脱时,峰形和分离度都无法达到要求。同时,对比了多种流速效果后,为了缩短分析时间同时获得比较理想的分离效果,最终选定在不同洗脱比例下使用不同流速。 图2 最优分离色谱图(略)Fig.2 Chromatogram of optimized separation1.5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural);2.原儿茶酸(Protocatechuic acid);3.(+)-儿茶素 ((+)-Catechin);4.绿原酸(Chlorogenic acid);5.咖啡酸(Caffeic acid);6.(-)-表儿茶素 ((-)-Epicatechin);7.丁香酸(Syringic acid);8.p-香豆酸(p-Coumaric acid);9.芦丁(Rutin);10.阿魏酸(Ferulic acid)。3.2.2 进样量的选择 通过比较进样量分别为5,10和20 μL的分离效果发现,当进样量过大时,色谱峰会出现拖尾峰或者前延峰,而且分离效果不佳。如果进样量太少,吸收少,有时会检测不到。最终选定进样量为10 μL。3.2.3 色谱条件的确定 由以上实验,最终确定分离HMF和多酚类物质的色谱条件是:检测波长280 nm,柱温42 ℃,进样量为10 μL, 3%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱(表1)。在此色谱条件下进样,得到多酚的标准色谱图(图2)。由图2可见, 10种物质得到了很好地分离,而且分离时间只有20 min。与已报道的方法[10,13]相比,分离时间及分离效果都得到了明显改善。3.3 分析方法的评价在已确定的色谱条件下,分别对不同浓度的标准溶液进样分析,根据平均峰面积与标准物质的含量关系进行线性回归,同时测得检出限(表2)。表2 10种物质的回归方程、检测限和相对标准偏差(n=5)(略)Table 2 Regression equations ,detection limits and relative standard deviations of 10 compounds(n=5)在各相应的线性范围内,相关系数r均大于0.99,表明线性关系良好,而且精密度高(相对标准偏差为1.2%~2.4%),能满足定量分析的要求。3.4 样品的测定及回收率的检测取3年陈的品牌I酒样,加入适量混合标准品溶液,混合均匀后,按“2.2”节色谱条件测定加标回收率,由表3可见,样品各组分的加标回收率为89.4%~98.3%; RSD为2.6%~5.3%。在2.2所述条件下,分别将两品牌4个不同陈化年份的酒样滤后进样,测定其中各物质的含量(图3,表4)。表3 10种物质的回收率(n=3)(略)Table 3 Recoveries of 10 components by HPLC analysis(n=3)图3 黄酒样品中多酚的色谱图(略)Fig.3 Chromatogram of HMF and phenolic compounds in different rice wines峰号同图2(Peak numbers are same as in Fig.2).表4 各黄酒样品中10种物质的含量测定结果(n=3)(略)Table 4 Determination results of 10 components in different rice wine samples(n=3)“-”未检出(not detected)。 由表4可以看出,黄酒中HMF含量随时间延长而增加。这是因为在黄酒陈化过程中一直进行Maillard反应所致。但是8年陈黄酒中HMF含量要高于10年陈,这可能由于陈化到一定时间后Maillard反应第3阶段占优势,HMF与其它物质交联导致含量降低[14];大部分多酚含量随陈化时间增长而下降,这可能由于陈化过程中多酚与蛋白交联产生沉淀而导致含量降低,这表明陈化时间越长的黄酒中多酚等活性成分含量越低,从营养保健的角度讲,并非越陈越好;有些多酚随陈化时间延长而含量增加,是因为其样品并非为同一批原料酿造而存在一定范围内的差异。