噬菌体展示技术在食品安全检测中的应用噬菌体展示技术用于食品安全检测的方法有:随机多肽噬菌体展示、单链F可变区抗体库(scFv)噬菌体展示、单域抗体(sdAbs)和域抗体(dAbs)噬菌体展示。当前,在食品检测方面多用于细菌病原体、病毒、支原体、毒素等方面。2.1 细菌病原体检测细菌病原体需要明确引发感染的细菌的细胞表面配基,随机多肽噬菌体展示技术可以用于鉴定与宿主蛋白相互作用的细菌蛋白的编码基因。用细菌基因组DNA构建噬菌体随机肽库(如鸟枪噬菌体展示肽库),这些基因组片段插入到噬菌体外壳蛋白质区,其编码的外源蛋白展示于噬菌体表面,然后用宿主成分进行筛选(如胞外基质中的蛋白、宿主血清或细胞质),这样就能鉴定出编码细菌细胞表面配基的基因。很多参与宿主与病原体(各个种属的细菌)相互作用的基因都是通过噬菌体展示系统发现的[2]。2006年,Gasanov等[11]采用了英格兰BioLabs公司随机12-Mer库检测李斯特菌细胞。李斯特菌是一种革兰氏阳性食物传染的细菌病原体能导致免疫功能低下者和孕妇、胎儿致命的疾病。Berger等[12]从M.副结核病引起的Johne氏病症的羊的身上,克隆出的DNA序列,创造更丰富的融合到噬菌体基因的M13gIII的单链抗体库。Balasubr amanian等[13]以溶源性噬菌体作探针,利用基于该方法的SPREETATM传感器,检测葡萄状链球菌,检测极限可达104cfu/mL。同样,Nanduri等[14]用pIII蛋白上展示有单抗scFv的噬菌体LmP4:A8为探针,检测了单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria.monocytohenes),检测极限可达到2×106cfu/mL;他们还检测了肌动纤维聚集因子actA蛋白,检测极限为4.5nmol/L。2.2 病毒利用噬菌体展示技术检测病毒分子首先用亲和层析加酶切的方法纯化病毒蛋白,用得到病毒蛋白分子筛选噬菌体12-Mer库,通过夹心ELASA法分析噬菌体克隆与病毒蛋白的亲和力,再利用硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序和序列分析[15]。从而得到能与病毒蛋白相互作用的短肽,这些短肽可以用于此类病毒的快速检测。2010年,Lei Song等[16]在一个杆状病毒基因工程中,用His6标记氧化锌结合肽被融合入AcNPV的病毒衣壳蛋白(vp39蛋白)的N-端。2011年,En-Cheng Sun等[17]研制出了西尼罗病毒C蛋白特异性单克隆抗体,利用噬菌体显示技术筛选12-Mer库得到的单克隆抗体识别确定了病毒的线性表位。2011年,Yongzhong Yu等[18]生产得到了血清型口蹄疫病的在相关单克隆抗体,4B2。通过筛选噬菌体展示随机12-Mer库,发现活跃的噬菌体展示出一致的基序ETTXLE(X为任何氨基酸(AA)),这是高度同源的在VP2(VP2是口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白)蛋白N-末端的6ETTLLE11高度同源。2.3 支原体2009年,Miltiadou等[19]构建能够展示MmmSC基因组片段表达的一种多肽的丝状噬菌体库,通过使用噬菌体展示鉴定支原体丝状亚种小群体(MmmSC)的B细胞抗原编码基因。支原体丝状亚种能够引起牛传染性胸膜肺炎(CBPP)。2.4 寄生虫A. ijiang Guo等[20]通过筛选含有单克隆抗体和一个TSOL18模拟表位的噬菌体展示多肽库,使得抗原表位被映射出来,这可以为诊断和研究猪带绦虫疫苗提供一个替代的方法。猪带绦虫是导致人类和猪囊尾蚴病的一种寄生虫,TSOL18已被确定为一个宿主保护六钩蚴抗原。获得对TSOL18鼠标单克隆抗体和映射的抗原表位对猪带绦虫感染的预防和疫苗的研发具有深远的作用。在这项研究中,单克隆抗体是以纯化的毕赤酵母中产生糖基化的TSOL18作为免疫原通过杂交瘤细胞技术生产的。B. u等[21]用夏氏鼠疟原虫DS顶端膜蛋白(AMA-1)免疫小鼠构建了单链可变区抗体(scFv)的展示肽文库,用折叠的AMA-1筛选肽文库富集了一群特异结合抗原的scFv,测序获得了至少4个不同的scFv基因序列,为进一步研究AMA-1的结构和功能奠定了基础。C. 2.5 过敏原D. 目前,运用不同的噬菌体库,可以筛选过敏原的线性表位和构象性表位的模拟肽,然后通过生物信息学的方法把模拟肽转变成相应的表位[22]。E. rameri等[23]通报利用噬菌体展示技术,通过高通量筛选烟曲霉过敏原的cDNA文库发现至少有81种编码结构的不同序列,这些序列编码的结构能够与患烟曲霉有关并发症的患者致敏血清中的lgE特异性结合。F. IgG为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机7 肽库,通过与β-乳球蛋白的氨基酸序列比对,确定了六个IgG识别表位。牛乳β-乳球蛋白由162个氨基酸残基组成,分子量约为18.4kDa,是牛乳中的主要过敏原之一。G. 2.6 毒素1单克隆抗体为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和淘选,ELISA鉴定阳性克隆,通过DNA测序对每个阳性克隆进行定性分析。通过4轮结合/扩增循环,获得了能与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合的肽,采用间接竞争ELISA,筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B1的阳性克隆子,经DNA测序得到HXXDPXH共有序列,其中X为任意氨基酸。以其中P10噬菌体阳性克隆建立竞争ELISA方法,线性范围为500~2000pg/ml,检测下限为50pg/ml。成功应用噬菌体展示技术筛选出AFB[24]的模拟抗原表位,建立了无需人工抗原的免疫学分析方法。Helicobacter Pylori, HP)空泡毒素(VacA)基因片段作为固相筛选分子,筛选幽门螺杆菌VacA基因结合蛋白,探索VacA致病机制,研究VacA致病机制,为HP疫苗的研制和治疗等提供依据。模拟表位。将带有OTA模拟表位序列的寡核苷酸双链克隆至载体pC89-COTA。利用噬菌体展示技术,通过优化辅助噬菌体感染复数、IPTG加入的时间与剂量等培养条件获得表达有高密度OTA模拟表位的噬菌体。再通过酶联免疫吸附检测(ELISA)方法比较不同的条件下的表达效果,探索最优表达条件。成功获得高密度表达OTA模拟表位的噬菌体,并发现辅助噬菌体感染复数与IPTG加入量对模拟表位表达量影响不大,IPTG加入时间对模拟表位表达量有较大影响。同时,通过在噬菌体表面展示OTA模拟表位,可以生产大量廉价无毒的OTA模拟表位噬菌体,为以后建立OTA的无毒ELISA分析方法提供稳定可靠的材料来源。2.7 化学农药richeta等[25]从构建的天然抗体库中筛出除草剂2,4-D的抗体。S-羧甲基-O, O-二甲基二硫代磷酸酯,CMP)连接至琼脂糖凝胶,进而对甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体进行纯化,以纯化抗体为固相抗原,以人源scFv抗体库(Tomlinson I + J)为抗体源,进行抗独特型抗体的筛选;利用所筛选到的抗独特型抗体建立非竞争免疫检测技术。经过鉴定,成功制备了甲氧基有机磷农药的β型和α型抗独特型抗体,并以此为基础建立了非竞争检测技术体系。