下列属于酶耦联法注意事项的是A. 指示酶反应必须是零级反应B. 测定时间要在延滞期内C. 工具酶所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行D. 延滞期越长越好，有较宽的测定范围E. 延滞期期间指示酶反应速度可代表测定酶含量

酶耦联法是通过指示酶的显色反应间接测定待测酶活性的方法。其核心在于中间产物的浓度控制，需确保工具酶反应处于零级反应条件（即反应速率与中间产物浓度无关）。关键注意事项包括：

1. 中间产物浓度需极低，使工具酶反应速率仅由其自身浓度决定；
2. 测定应在稳定期，此时中间产物浓度恒定，反应速率稳定；
3. 延滞期不宜过长，否则会缩小测定范围。

选项分析

A. 指示酶反应必须是零级反应

正确。零级反应确保工具酶的反应速率与中间产物浓度无关，仅由待测酶活性决定。但本题问的是“注意事项”，而非原理，因此非最优选项。

B. 测定时间要在延滞期内

错误。延滞期是中间产物积累阶段，反应速率不稳定，应选择稳定期进行测定。

C. 工具酶所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行

正确。中间产物浓度极低时，工具酶反应进入零级反应区，保证速率与待测酶活性线性相关，是关键注意事项。

D. 延滞期越长越好，有较宽的测定范围

错误。延滞期过长会降低检测效率，测定范围反而缩小，需合理控制延滞期长度。

E. 延滞期期间指示酶反应速度可代表测定酶含量

错误。延滞期反应速率不稳定，仅稳定期的速率可用于定量分析。