题目
解磷菌是一种能将土壤中植物不能利用的磷转化为植物可以利用磷的功能微生物（主要为细菌），在提高土壤中有效磷含量、促进磷循环方面发挥着重要作用。解磷菌能分解含磷化合物使得菌落周围会出现透明圈。如图1为从某植物根际土壤中筛选出高效解磷菌的部分流程示意图，步骤Ⅰ表示将1g土壤加入到100mL灭过菌的PVK培养基培养。36h后，取10mL培养液接种于100mLPVK培养基继续富集培养；连续富集培养3次后进行实验步骤Ⅱ—Ⅳ（B、C中培养基的营养成分与A相同）。请据图回答：ll yung W a 1-|||-挑菌 s 小=-|||-土壤 0mL B 纯化 c D 30 cycles-|||-A-|||-图1-|||-循环结束后,72℃保温1min（1）用于培养解磷菌的培养基在接种前需要通过 ____ 法进行灭菌。从成分上看，与A相比，B中多了 ____ （填物质名称）。（2）在操作Ⅱ、Ⅲ中，采用的接种方法分别是 ____ 、 ____ 。（3）为了尽快观察到解磷菌培养的实验结果，应将接种了样品的平板倒置于 ____ 中培养，并同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验。（4）在固体培养基中分离培养出解磷菌后，需通过测量 ____ 直径，比较它们的比值以确定其解磷能力从而筛选出目标菌株。（5）分离出的解磷菌，需通过分子鉴定以确定种属关系。常用的方法是对细菌的核糖体RNA（16SrRNA）所对应的16SrDNA进行序列分析（基因公司测序），在测序前一般采用菌落PCR的方法进行扩增。①菌落PCR直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，与传统PCR相比省时省力，其原因是 ____ 。②在PCR实验中，按照图的设计设置好PCR程序，其中a表示 ____ ，常采用 ____ 来鉴定PCR的产物。③在进行菌落PCR时，首先根据 ____ 两端的脱氧核苷酸序列来设计引物。已知相关的上游引物序列为5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，则下游引物的序列最合适的是 ____ 。a.5′-ACAATATGTATAATCT-3′b.5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′c.5′-GCAATGCGTGCATTGC-3′d.5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′
解磷菌是一种能将土壤中植物不能利用的磷转化为植物可以利用磷的功能微生物（主要为细菌），在提高土壤中有效磷含量、促进磷循环方面发挥着重要作用。解磷菌能分解含磷化合物使得菌落周围会出现透明圈。如图1为从某植物根际土壤中筛选出高效解磷菌的部分流程示意图，步骤Ⅰ表示将1g土壤加入到100mL灭过菌的PVK培养基培养。36h后，取10mL培养液接种于100mLPVK培养基继续富集培养；连续富集培养3次后进行实验步骤Ⅱ—Ⅳ（B、C中培养基的营养成分与A相同）。请据图回答：
（1）用于培养解磷菌的培养基在接种前需要通过 ____ 法进行灭菌。从成分上看，与A相比，B中多了 ____ （填物质名称）。
（2）在操作Ⅱ、Ⅲ中，采用的接种方法分别是 ____ 、 ____ 。
（3）为了尽快观察到解磷菌培养的实验结果，应将接种了样品的平板倒置于 ____ 中培养，并同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验。
（4）在固体培养基中分离培养出解磷菌后，需通过测量 ____ 直径，比较它们的比值以确定其解磷能力从而筛选出目标菌株。
（5）分离出的解磷菌，需通过分子鉴定以确定种属关系。常用的方法是对细菌的核糖体RNA（16SrRNA）所对应的16SrDNA进行序列分析（基因公司测序），在测序前一般采用菌落PCR的方法进行扩增。
①菌落PCR直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，与传统PCR相比省时省力，其原因是 ____ 。
②在PCR实验中，按照图的设计设置好PCR程序，其中a表示 ____ ，常采用 ____ 来鉴定PCR的产物。
③在进行菌落PCR时，首先根据 ____ 两端的脱氧核苷酸序列来设计引物。已知相关的上游引物序列为5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，则下游引物的序列最合适的是 ____ 。
a.5′-ACAATATGTATAATCT-3′
b.5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
c.5′-GCAATGCGTGCATTGC-3′
d.5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′
（1）用于培养解磷菌的培养基在接种前需要通过 ____ 法进行灭菌。从成分上看，与A相比，B中多了 ____ （填物质名称）。
（2）在操作Ⅱ、Ⅲ中，采用的接种方法分别是 ____ 、 ____ 。
（3）为了尽快观察到解磷菌培养的实验结果，应将接种了样品的平板倒置于 ____ 中培养，并同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验。
（4）在固体培养基中分离培养出解磷菌后，需通过测量 ____ 直径，比较它们的比值以确定其解磷能力从而筛选出目标菌株。
（5）分离出的解磷菌，需通过分子鉴定以确定种属关系。常用的方法是对细菌的核糖体RNA（16SrRNA）所对应的16SrDNA进行序列分析（基因公司测序），在测序前一般采用菌落PCR的方法进行扩增。
①菌落PCR直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，与传统PCR相比省时省力，其原因是 ____ 。
②在PCR实验中，按照图的设计设置好PCR程序，其中a表示 ____ ，常采用 ____ 来鉴定PCR的产物。
③在进行菌落PCR时，首先根据 ____ 两端的脱氧核苷酸序列来设计引物。已知相关的上游引物序列为5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，则下游引物的序列最合适的是 ____ 。
a.5′-ACAATATGTATAATCT-3′
b.5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
c.5′-GCAATGCGTGCATTGC-3′
d.5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′
题目解答
答案
解：（1）对培养基灭菌常采用的方法是高压蒸汽灭菌。B培养基在培养皿中，而A培养基在锥形瓶中，意味着B中加入了琼脂，是固体培养基。
（2）操作Ⅱ过程可以看到菌落在培养基中均匀分布，接种方法是稀释涂布平板法；操作Ⅲ为挑菌落进一步纯化，需要用接种环进一步稀释菌体，所以是平板划线法。
（3）接种完成后，需将平板倒置于无菌培养箱中培养，还需提供适宜的温度。
（4）解磷菌分解磷后会形成透明圈，通过比较透明圈和菌落直径的比值来确认其解磷能力从而筛选出目标菌株。
（5）①据题意可知，直接以菌体热解后暴露的DNA为模板扩增，而传统PCR需要从细胞中提取目的基因或人工合成目的基因，因此菌落PCR与传统PCR相比省时省力。
②a为94℃，5min，其为PCR预热条件，故此步为预变性；常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
③引物设计要根据16SrDNA（目的基因）两端的脱氧核苷酸序列来设计，两个引物之间不应存在互补序列，已知上游引物序列为5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，分析各选项，从避免碱基互补配对的原则来说，下游引物的序列最合适的是5′—TCATGAGCGCATAGTT—3'。
故选：b。
故答案为：
（1）高压蒸汽灭菌 琼脂
（2）稀释涂布平板法 平板划线法
（3）恒温箱
（4）透明圈和菌落
（5）不需要从细胞中提取目的基因或人工合成目的基因 预变性 琼脂糖凝胶电泳 16SrDNA b
（2）操作Ⅱ过程可以看到菌落在培养基中均匀分布，接种方法是稀释涂布平板法；操作Ⅲ为挑菌落进一步纯化，需要用接种环进一步稀释菌体，所以是平板划线法。
（3）接种完成后，需将平板倒置于无菌培养箱中培养，还需提供适宜的温度。
（4）解磷菌分解磷后会形成透明圈，通过比较透明圈和菌落直径的比值来确认其解磷能力从而筛选出目标菌株。
（5）①据题意可知，直接以菌体热解后暴露的DNA为模板扩增，而传统PCR需要从细胞中提取目的基因或人工合成目的基因，因此菌落PCR与传统PCR相比省时省力。
②a为94℃，5min，其为PCR预热条件，故此步为预变性；常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
③引物设计要根据16SrDNA（目的基因）两端的脱氧核苷酸序列来设计，两个引物之间不应存在互补序列，已知上游引物序列为5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，分析各选项，从避免碱基互补配对的原则来说，下游引物的序列最合适的是5′—TCATGAGCGCATAGTT—3'。
故选：b。
故答案为：
（1）高压蒸汽灭菌 琼脂
（2）稀释涂布平板法 平板划线法
（3）恒温箱
（4）透明圈和菌落
（5）不需要从细胞中提取目的基因或人工合成目的基因 预变性 琼脂糖凝胶电泳 16SrDNA b