题目

25.（12分）CRISPR/CAS9基因组编辑技术源于细菌抵御噬菌体的机理研究。细菌被特定噬菌体感染后，细菌Cas2会随机切断人侵的嗞菌体DNA双链，并将切下的一个DNA片段（原型间隔序列）插入CRISPR位点（由间隔序列和重复序列交替排列组成的基因序列）的重复序列中，构成新的间隔序列，形成“免疫记忆”。当同种噬菌体再次入侵时，由CRISPR位点的新的间隔序列转录产生的crRNA便会将另一种蛋白质（如Cas9）准确带入到入侵者的原间隔序列DNA处，并将之切断，即“免疫灭杀”。CRISPR/Cas9基因编辑技术中sgRNA（单向导RNA）是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，对DNA序列中的原型间隔序列相邻基序具有较高的编辑效率，如图所示。回答下列问题:原型间隔序列 PAM-|||-5` Cas9 3`-|||-3` 5`-|||-xi60-|||-5 II-|||-引导序列,20nt-|||-sgRNA bigcirc -|||-3（1）细菌Cas2基因表达Cas2的过程需要细菌提供_____________等原料，Cas2和Cas9在功能上都属于_酶，可催化_____（化学键）水解。（2）CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与细菌体内的_功能相同，都可以与相应靶基因序列发生碱基互补配对。细菌利用该防御机制可以有效抵抗噬菌体的二次入侵，但是仍然会有部分噬菌体能够继续侵染已经获得免疫能力的宿主菌，原因可能是:_（3）CR1SPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18-20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链，从而为Cas9切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应，提出可能的思路:（4）研究证实，人低氧诱导因子（HIF-1α）表达水平与肝癌的发生发展具有密切关系，HIF-1α在肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HIF-1α基因为肝癌治疗提供了新途径。科研人员构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9重组质粒，并用重组质粒对肝癌细胞进行转染，利用其敲除肝癌细胞中的HIF-1α基因，并通过12孔板错选获得了基因敲除的混合克隆细胞株，然后用HIF-1α表达诱导剂（CoCl2）诱导相关细胞，提取蛋白，用Westernblot法（分离检测蛋白质的一种方法）检测HIF-1α蛋白的表达，以相应条带灰度值（越大）表示表达水平（越高）。下图为三类细胞HIF-1α蛋白的检测结果:原型间隔序列 PAM-|||-5` Cas9 3`-|||-3` 5`-|||-xi60-|||-5 II-|||-引导序列,20nt-|||-sgRNA bigcirc -|||-3请尝试分析图示实验结果及结论:________

25.（12分）CRISPR/CAS9基因组编辑技术源于细菌抵御噬菌体的机理研究。细菌被特定噬菌体感染后，细菌Cas2会随机切断人侵的嗞菌体DNA双链，并将切下的一个DNA片段（原型间隔序列）插入CRISPR位点（由间隔序列和重复序列交替排列组成的基因序列）的重复序列中，构成新的间隔序列，形成“免疫记忆”。当同种噬菌体再次入侵时，由CRISPR位点的新的间隔序列转录产生的crRNA便会将另一种蛋白质（如Cas9）准确带入到入侵者的原间隔序列DNA处，并将之切断，即“免疫灭杀”。CRISPR/Cas9基因编辑技术中sgRNA（单向导RNA）是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，对DNA序列中的原型间隔序列相邻基序具有较高的编辑效率，如图所示。回答下列问题:

（1）细菌Cas2基因表达Cas2的过程需要细菌提供_____________________等原料，Cas2和Cas9在功能上都属于_______________酶，可催化_________________（化学键）水解。

（2）CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与细菌体内的_____________功能相同，都可以与相应靶基因序列发生碱基互补配对。细菌利用该防御机制可以有效抵抗噬菌体的二次入侵，但是仍然会有部分噬菌体能够继续侵染已经获得免疫能力的宿主菌，原因可能是:___________

（3）CR1SPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18-20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链，从而为Cas9切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应，提出可能的思路:________________________

（4）研究证实，人低氧诱导因子（HIF-1α）表达水平与肝癌的发生发展具有密切关系，HIF-1α在肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HIF-1α基因为肝癌治疗提供了新途径。科研人员构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9重组质粒，并用重组质粒对肝癌细胞进行转染，利用其敲除肝癌细胞中的HIF-1α基因，并通过12孔板错选获得了基因敲除的混合克隆细胞株，然后用HIF-1α表达诱导剂（CoCl2）诱导相关细胞，提取蛋白，用Westernblot法（分离检测蛋白质的一种方法）检测HIF-1α蛋白的表达，以相应条带灰度值（越大）表示表达水平（越高）。下图为三类细胞HIF-1α蛋白的检测结果:

请尝试分析图示实验结果及结论:____________________________

题目解答

答案

（1）细菌Cas2基因表达Cas2的过程发生转录和翻译，需要细菌提供核糖核苷酸和氨基酸等原料，Cas2和Cas9在功能上都属于限制性核酸内切酶，可催化磷酸二酯键水解。

（2）转录时，通过碱基互补配对原则，mRNA与DNA配对，故CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与细菌体内的mRNA功能相同，都可以与相应靶基因序列发生碱基互补配对。根据题干，可知“免疫灭杀”需要crRNA发挥作用。细菌利用该防御机制可以有效抵抗噬菌体的二次入侵，但是仍然会有部分噬菌体能够继续侵染已经获得免疫能力的宿主菌，说明crRNA没有将蛋白质准确带入到入侵者的原间隔序列DNA处，原因可能是部分宿主菌的crRNA没有转录成功。

（3）根据题干，sgRNA与靶基因的准确配对很关键。若不能准确配对，可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险，所以要想降低脱靶效应，应当设计出特异性较强的sgRNA，增强sgRNA的特异性

（4）根据题干，能看出1、2是对照组，3是实验组。由于相应条带灰度值（越大）表示表达水平（越高），所以实验结果是未转染＋诱导、转染＋诱导、未转染＋未诱导的HIF-1α表达量依次递减；结论是该细胞的重组质粒转染成功，因为其能在CoCl2的诱导下，显著降低HIF-1α的表达量。

答案：

（1）核糖核苷酸、氨基酸；限制性核酸内切酶；磷酸二酯键

（2）mRNA ；部分宿主菌的 crRNA 没有转录成功

（3）设计出特异性较强的 sgRNA ，增强 sgRNA 的特异性

（4）实验结果：未转染＋诱导、转染＋诱导、未转染＋未诱导的 HIF - 1α 表达量依次递减；结论：该细胞的重组质粒转染成功，因为其能在 CoCl2的诱导下，显著降低 HIF - 1α 的表达量。