某实验室拟通过基因工程改良新疆棉纤维品质，在构建重组DNA分子时，需同时使用EcoRI（识别序列GAATTC）和BamHI（识别序列GGATCC）两种限制酶切割目的基因和载体。若仅使用EcoRI单酶切，最可能导致的问题是？A. 目的基因无法与载体连接B. 产生反向连接或自身环化C. 限制酶切割效率显著降低D. 载体抗生素抗性基因失活E. 目的基因转录起始位点丢失

本题考查基因工程中限制酶切割的相关知识以及单酶切可能带来的问题。解题的关键在于理解不同限制酶切割切割产生的末端特点以及单酶切和双酶切的区别对后续连接过程的影响。

• 双酶切的优势：在基因工程中，使用两种不同的限制酶（如本题中的EcoRI和BamHI）进行双酶切，会使目的基因和载体产生不同的黏性末端。例如，EcoRI切割GAATTC会产生GAATTC的黏性末端，BamHI切割GGATCC会产生GGATCC的黏性末端。这些不同的黏性末端具有特异性，只有互补的末端才能相互连接，这样就大大提高了目的基因与载体正确连接的效率，同时也避免了目的基因自身环化以及反向连接的问题。
• 单酶切的问题：若仅使用EcoRI单酶切，目的基因和载体两端产生的是相同的黏性末端。在DNA连接酶的作用下，这些相同的黏性末端之间可以相互连接。这就可能导致以下两种情况：
  • 自身环化：目的基因的两端相互连接，形成一个环状的DNA分子，而不是与载体连接。
  • 反向连接：目的基因以相反的方向连接到载体上，这可能会影响目的基因的正常表达。