题目
11．今有以下四种蛋白质的混合物：（A）相对分子质量 12000，pI 10；（B）相对分子质量 62000，pI 4；（C）相对分子质量 28000，pI 7；（D）相对分子质量 9000，pI 5。若不考虑其他因素，当它们：（1）流过 DEAE-纤维素阴离子交换柱，用缓冲液 pH8.8 和线性 NaCl 盐梯度洗脱时；（2）流经 Sephadex G-75凝胶过滤柱时，这些蛋白质的洗脱顺序如何？并简单说明原因。[华南农业大学 2009研]
11．今有以下四种蛋白质的混合物：（A）相对分子质量 12000，pI 10；（B）相对分子质量 62000，pI 4；（C）相对分子质量 28000，pI 7；（D）相对分子质量 9000，pI 5。若不考虑其他因素，当它们：（1）流过 DEAE-纤维素阴离子交换柱，用缓冲液 pH8.8 和线性 NaCl 盐梯度洗脱时；（2）流经 Sephadex G-75凝胶过滤柱时，这些蛋白质的洗脱顺序如何？并简单说明原因。[华南农业大学 2009研]
题目解答
答案
答：（1）在 DEAE-纤维素阴离子交换柱层析中，蛋白质有不同的 pI，在同一 pH下，各种蛋白质所带的电荷的种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用的强弱不同。带负电荷少，吸附能力弱的先洗脱下来，带负电荷多，吸附能力强的后洗脱下来，从而将蛋白质混合物分开，据此分析可知四种蛋白质的洗脱顺序为：（A）、（C）、（D）、（B）。（2）在 Sephadex G-75 凝胶过滤柱时，小颗粒（小分子质量）进入凝胶的孔内扩散，流动速度慢，后洗脱；大颗粒（大分子量）不进入凝胶的孔内，滑动速度快，先洗脱。据此分析可知四种蛋白质的洗脱顺序为：（B）、（C）、（A）、（D）。
解析
阴离子交换层析的关键在于蛋白质的等电点（pI）与流动相pH的关系。当pH > pI时，蛋白质带负电，可与阴离子交换柱结合。结合能力由所带负电荷数量决定：负电荷越多，吸附越强，洗脱越晚。因此，需比较各蛋白质在pH8.8时的带电情况。
凝胶过滤层析的分离依据是分子量，大分子因无法深入凝胶孔隙而先洗脱，小分子后洗脱。因此，直接按分子量从大到小排序即可。
第（1）题
- 判断带电情况：
- A（pI=10）：pH8.8 < pI，带正电，不吸附，最先洗脱。
- B（pI=4）、C（pI=7）、D（pI=5）：pH8.8 > pI，均带负电。
- 比较负电荷数量：
负电荷数量与（pH - pI）成正比：- B：pH - pI = 4.8 → 最多负电荷 → 最后洗脱。
- D：pH - pI = 3.8 → 次多 → 中间洗脱。
- C：pH - pI = 1.8 → 最少 → 先于D洗脱。
洗脱顺序：A > C > D > B。
第（2）题
- 按分子量排序：
B（62000）> C（28000）> A（12000）> D（9000）。 - 大分子先洗脱：
洗脱顺序：B > C > A > D。