题目

乙醇脱氢酶催化如下反应:乙醇 +NAD^+ 乙醛 +NADH+(H)^+(1)已知反应体系中NADH在340nm有吸收峰,其他物质在该波长处的吸光度均接近于零,请设计一种测定酶活力的方法。(2)如何确定在实验中测得的酶促反应速率是真正的初速率?(3)在实验中使用了一种抑制剂,下表中是在分别存在与不存在抑制剂I的情况下测定的对应不同底物浓度的酶促反应速率,请利用表中的数据计算其各自对应的Km与Vmax值,并判断抑制剂的类型。[S]/(mmol/L)v/ (molL-1min-1)[I] = 0[I] = 10 mmol/L205.2633.999155.0013.636104.7623.22254.2642.1152.53.3331.3161.62.770.926

乙醇脱氢酶催化如下反应:
(1)已知反应体系中NADH在340nm有吸收峰,其他物质在该波长处的吸光度均接近于零,请设计一种测定酶活力的方法。
(2)如何确定在实验中测得的酶促反应速率是真正的初速率?
(3)在实验中使用了一种抑制剂,下表中是在分别存在与不存在抑制剂I的情况下测定的对应不同底物浓度的酶促反应速率,请利用表中的数据计算其各自对应的Km与Vmax值,并判断抑制剂的类型。
[S]/(mmol/L)
v/ (molL-1min-1)
[I] = 0
[I] = 10 mmol/L
20
5.263
3.999
15
5.001
3.636
10
4.762
3.222
5
4.264
2.115
2.5
3.333
1.316
1.6
2.77
0.926

题目解答

答案

解答:(1)选择合适的底物浓度(NAD+与乙醇)与缓冲体系,取一定体积的底物溶液(如1ml)加入石英比色杯,加入适量酶,迅速混合后,放入紫外/可见光分光光度计的样品室内,测定反应体系在340 nm吸光度随时间的变化曲线。利用NADH的摩尔吸光系数(可从相关文献查到,或用已知浓度的NADH溶液自行测定),计算出单位时间内NADH的增加量,用于表示酶活力。
(2)如果在选取的测量时间范围内,反应体系在340 nm吸光度随时间的变化曲线接近一条直线的形状,则表明反应速率在此时间段内保持不变,可用来代表反应初速率。
(3)用Lineweaver-Burk双倒数作图法,结果如下:
Km与Vmax值
抑制剂浓度
[I] = 0
[I] = 10 mmol/L
Km/(mmolL1、)
1.643
8.244
Vmax/(molL1、min1、)
5.64
5.64
抑制剂的类型:竞争性可逆抑制剂。

解析

步骤 1：设计测定酶活力的方法
由于NADH在340nm有吸收峰，其他物质在该波长处的吸光度均接近于零，因此可以利用NADH的吸光度变化来测定酶活力。选择合适的底物浓度（NAD+与乙醇）与缓冲体系，取一定体积的底物溶液（如1ml）加入石英比色杯，加入适量酶，迅速混合后，放入紫外/可见光分光光度计的样品室内，测定反应体系在340 nm吸光度随时间的变化曲线。利用NADH的摩尔吸光系数（可从相关文献查到，或用已知浓度的NADH溶液自行测定），计算出单位时间内NADH的增加量，用于表示酶活力。

步骤 2：确定实验中测得的酶促反应速率是真正的初速率
如果在选取的测量时间范围内，反应体系在340 nm吸光度随时间的变化曲线接近一条直线的形状，则表明反应速率在此时间段内保持不变，可用来代表反应初速率。

步骤 3：计算Km与Vmax值并判断抑制剂的类型
利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，将实验数据进行处理，得到如下结果：
- 当[I] = 0时，Km = 1.643 mmol/L，Vmax = 5.64 mol/(L·min)
- 当[I] = 10 mmol/L时，Km = 8.244 mmol/L，Vmax = 5.64 mol/(L·min)
由于Vmax值不变，而Km值增加，说明抑制剂I为竞争性可逆抑制剂。