题目
PCR是聚合酶链式反应的缩写，常用于特异性地快速扩增目的基因，应用广泛。回答下列问题。EcoR I-|||-BamH BamH I-|||-绿色荧光 Xho I-|||-蛋白基因 P区-|||-A终止子 引物 启动子S-|||-=-|||-氨卡青霉索 Sma IEcoR I引物Ⅱ-|||-抗性基因-|||-启动子 注:箭头所指为启动子S内部存在的酶切位点-|||-终止子 图1-|||--(C)_(A)(A)_(G)C(H)_(3)C... ... cdot C(AACC-3) 拟突变位点 引物2 引物4-|||--cmCAG... ... ... 6CTTGG-S 3/5-|||-引物1 PCR1 引物3-|||-图2 第选选 筛选PCR2-|||-5RNA wwww 3 =3/5-|||-3 A 5-|||-5~~ 5-|||-________ =3/5-|||-3. DDA |2 混合、变形后,杂交-|||-3 5 -3'-|||-一 3 |使用DNA聚合酶廷伸-|||-3-|||-一-|||-PCR3-|||-3 ?选选 3/5-|||-图3 图4（1）研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方向）插入图中载体P区构建表达载体，转入大肠杆菌以获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。根据启动子方向以及终止子位置，PCR扩增启动子S时，图1中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入限制酶 ____ 的识别序列。（2）利用PCR方法克隆某蛋白质的基因（部分序列如图2）。扩增该基因的合适引物组合是 ____ 。通过引物的设计， ____ （填“能”或“不能”）做到选择性扩增DNA片段。（3）实时荧光RT-PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA（cDNA）序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增（具体过程如图3所示）。利用RT-PCR技术提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度，其原因是 ____ 。（4）利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理如图4所示。进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，因此 ____ （填“需要”或“不需要”）另加引物，即可得到进行PCR3筛选的突变产物。图示过程实现的基因序列改变属于基因突变， ____ （填“有”或“没有”）发生基因重组。
PCR是聚合酶链式反应的缩写，常用于特异性地快速扩增目的基因，应用广泛。回答下列问题。
（1）研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方向）插入图中载体P区构建表达载体，转入大肠杆菌以获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。根据启动子方向以及终止子位置，PCR扩增启动子S时，图1中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入限制酶 ____ 的识别序列。
（2）利用PCR方法克隆某蛋白质的基因（部分序列如图2）。扩增该基因的合适引物组合是 ____ 。通过引物的设计， ____ （填“能”或“不能”）做到选择性扩增DNA片段。
（3）实时荧光RT-PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA（cDNA）序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增（具体过程如图3所示）。利用RT-PCR技术提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度，其原因是 ____ 。
（4）利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理如图4所示。进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，因此 ____ （填“需要”或“不需要”）另加引物，即可得到进行PCR3筛选的突变产物。图示过程实现的基因序列改变属于基因突变， ____ （填“有”或“没有”）发生基因重组。
（1）研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方向）插入图中载体P区构建表达载体，转入大肠杆菌以获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。根据启动子方向以及终止子位置，PCR扩增启动子S时，图1中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入限制酶 ____ 的识别序列。
（2）利用PCR方法克隆某蛋白质的基因（部分序列如图2）。扩增该基因的合适引物组合是 ____ 。通过引物的设计， ____ （填“能”或“不能”）做到选择性扩增DNA片段。
（3）实时荧光RT-PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA（cDNA）序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增（具体过程如图3所示）。利用RT-PCR技术提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度，其原因是 ____ 。
（4）利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理如图4所示。进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，因此 ____ （填“需要”或“不需要”）另加引物，即可得到进行PCR3筛选的突变产物。图示过程实现的基因序列改变属于基因突变， ____ （填“有”或“没有”）发生基因重组。
题目解答
答案
解：（1）根据图1分析可知，目的基因中存在限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ的识别序列；若用这两种酶进行切割，会破坏目的基因，故不能选择；为了防止目的基因和质粒自身环化和反向连接，质粒和目的基因应该用XhoⅠ、BamHⅠ切割。根据启动子方向以及终止子位置，PCR扩增启动子S时，图中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入XhoⅠ、BamHⅠ的识别序列。
（2）引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，引物与模板链的3'端结合，因此，扩增该基因的合适引物组合是5'—GAAGTC—3'、3'—GCTTGG—5'。引物是根据目的基因两端的脱氧核苷酸序列设计的，通过引物的设计，能做到选择性扩增DNA片段。
（3）若RNA数量较少时，不容易进行检测，但利用RT-PCR技术可增加待测RNA逆转录产生的DNA的数量，从而提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度。
（4）进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物的作用，二者之间互为模板和引物，不需要再另加引物，就能够得到进行PCR3筛选的突变产物。该过程发生了基因内部碱基对的替换，属于基因突变，没有发生基因重组。
故答案为：
（1）XhoⅠ、BamHⅠ
（2）5'—GAAGTC—3'、3'—GCTTGG—5'；能
（3）增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量
（4）不需要 没有
（2）引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，引物与模板链的3'端结合，因此，扩增该基因的合适引物组合是5'—GAAGTC—3'、3'—GCTTGG—5'。引物是根据目的基因两端的脱氧核苷酸序列设计的，通过引物的设计，能做到选择性扩增DNA片段。
（3）若RNA数量较少时，不容易进行检测，但利用RT-PCR技术可增加待测RNA逆转录产生的DNA的数量，从而提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度。
（4）进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物的作用，二者之间互为模板和引物，不需要再另加引物，就能够得到进行PCR3筛选的突变产物。该过程发生了基因内部碱基对的替换，属于基因突变，没有发生基因重组。
故答案为：
（1）XhoⅠ、BamHⅠ
（2）5'—GAAGTC—3'、3'—GCTTGG—5'；能
（3）增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量
（4）不需要 没有