题目

兼具了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体的优点。【注：只有插入的外源DNA片段至少达到30kb长，才能包装成具有感染性的λ噬菌体颗粒，柯斯质粒载体在克隆大片段DNA分子时特别有效。】【第四章目的基因的制备】目的基因的制备方法（所有的基本原理，各自在什么情况下用什么方法）【1、直接分离法（目的基因已掌握，才能用）】1)________（适用于从简单基因组中分离目的基因）详见56a.对________的DNA分子；b.对已知________的目的基因，根据目的基因两侧的已知内切酶识别位点进行酶切。c.通过酶切对________的DNA分子，________，再进一步调取目的基因。2)基因分离的物理化学法（一般了解）a密度梯度离心法b单链酶解法c分子杂交法原理：不同基因片段剪辑________和________不同。3)双抗体免疫法分离编码蛋白的基因P56【其基本原理】核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白。从细胞匀浆液中制备这种多聚核糖核蛋白体，并同由待分离基因表达的蛋白产物制备的特定抗体一起保温，形成多聚核糖体同抗体的复合物。这种复合体数量少，难以从细胞总多聚核糖体分离出来。但加入由此特定蛋白的抗体产生的第二抗体时就可以通过不连续蔗糖梯度离心，将所要的含有特定mRNA多聚核糖体从总多聚核糖体分离出来，再通过酚、氯仿抽提去除蛋白，柱层析，就可以得到特定蛋白编码的mRNA。【注：材料细胞（如：种子细胞）提取全部蛋白，分离该蛋白，纯化至单一成分，将得到的基因表达蛋白注入受体（小兔），得到抗体，分离单一抗体，器官组织分离捣碎，溶解于缓冲液，放入抗体，抗体与多聚核糖体结合，沉淀离心，得到mRNA，逆转录得到DNA。4)利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因原理：以目的基因的________为模板，在________的作用下合成互补的________，即________，然后在________________的催化下合成________________片段，与适当的________重组后________，获得目的基因的cDNA________。【2、构建基因组文库法（目的基因不能查到，没有资料可查）】【A基因文库】：某种生物的基因组的全部遗传性息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因文库。【步骤】：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的氨基酸片段R有机的连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖的构成各个片段的无性繁殖克隆，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一克隆的总体被称为生物的基因文库。【意义】：保存基因（对难以获得的材料而言）。【BcDNA文库的构建】：利用某种生物的________________________________，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞进行繁殖、保存和扩增，称cDNA文库。cDNA：以RNA为模板逆转录出的DNA，________【cDNA基因文库构建的一般步骤】：（过程要分析，不能简单的回答）（1）总mRNA提取与mRNA的分离纯化原理：利用mRNA都有一段PolyA尾巴将mRNA从总RNA（tRNA、rRNA）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。提取总RNA有商业化的试剂盒，分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。（2）cDNA的合成与克隆原理：

兼具了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体的优点。【注：只有插入的外源DNA片段至少达到30kb长，才能包装成具有感染性的λ噬菌体颗粒，柯斯质粒载体在克隆大片段DNA分子时特别有效。】【第四章目的基因的制备】目的基因的制备方法（所有的基本原理，各自在什么情况下用什么方法）【1、直接分离法（目的基因已掌握，才能用）】1)________（适用于从简单基因组中分离目的基因）详见56a.对________的DNA分子；b.对已知________的目的基因，根据目的基因两侧的已知内切酶识别位点进行酶切。c.通过酶切对________的DNA分子，________，再进一步调取目的基因。2)基因分离的物理化学法（一般了解）a密度梯度离心法b单链酶解法c分子杂交法原理：不同基因片段剪辑________和________不同。3)双抗体免疫法分离编码蛋白的基因P56【其基本原理】核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白。从细胞匀浆液中制备这种多聚核糖核蛋白体，并同由待分离基因表达的蛋白产物制备的特定抗体一起保温，形成多聚核糖体同抗体的复合物。这种复合体数量少，难以从细胞总多聚核糖体分离出来。但加入由此特定蛋白的抗体产生的第二抗体时就可以通过不连续蔗糖梯度离心，将所要的含有特定mRNA多聚核糖体从总多聚核糖体分离出来，再通过酚、氯仿抽提去除蛋白，柱层析，就可以得到特定蛋白编码的mRNA。【注：材料细胞（如：种子细胞）提取全部蛋白，分离该蛋白，纯化至单一成分，将得到的基因表达蛋白注入受体（小兔），得到抗体，分离单一抗体，器官组织分离捣碎，溶解于缓冲液，放入抗体，抗体与多聚核糖体结合，沉淀离心，得到mRNA，逆转录得到DNA。4)利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因原理：以目的基因的________为模板，在________的作用下合成互补的________，即________，然后在________________的催化下合成________________片段，与适当的________重组后________，获得目的基因的cDNA________。【2、构建基因组文库法（目的基因不能查到，没有资料可查）】【A基因文库】：某种生物的基因组的全部遗传性息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因文库。【步骤】：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的氨基酸片段R有机的连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖的构成各个片段的无性繁殖克隆，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一克隆的总体被称为生物的基因文库。【意义】：保存基因（对难以获得的材料而言）。【BcDNA文库的构建】：利用某种生物的________________________________，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞进行繁殖、保存和扩增，称cDNA文库。cDNA：以RNA为模板逆转录出的DNA，________【cDNA基因文库构建的一般步骤】：（过程要分析，不能简单的回答）（1）总mRNA提取与mRNA的分离纯化原理：利用mRNA都有一段PolyA尾巴将mRNA从总RNA（tRNA、rRNA）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。提取总RNA有商业化的试剂盒，分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。（2）cDNA的合成与克隆原理：

题目解答

答案

内切酶酶切分离法已定序定位无定序构建基因文库浮力密度解链温度mRNA逆转录酶DNAcDNADNA聚合酶双链cDNA载体转入受体菌克隆总RNA合成cDNA没有内含子。

解析

本题考查目的基因制备方法的核心知识点，涉及直接分离法、构建基因组文库法、cDNA文库构建等方法的具体步骤和原理。解题关键在于：

  1. 区分不同方法的适用场景：直接分离法适用于已知目的基因序列的情况，而基因组文库法用于未知序列的情况。
  2. 掌握关键术语：如内切酶酶切分离法的步骤、反转录法的模板与产物、cDNA文库的特点（无内含子）。
  3. 理解方法间的逻辑关系：例如，cDNA文库需从mRNA出发，通过逆转录和PCR扩增等步骤构建。

1. 直接分离法

内切酶酶切分离法

  • 适用对象：从已定序的简单基因组中分离目的基因。
  • 操作步骤：
    • 对已定序的DNA分子，根据已知目的基因两侧的内切酶识别位点进行酶切。
    • 通过酶切对无定序的DNA分子进行切割，调取目的基因片段。
    • 最终通过构建基因文库保存目的基因。

基因分离的物理化学法

  • 原理：不同基因片段的浮力密度和解链温度不同，可通过密度梯度离心等方法分离。

2. 酶促反转录法

  • 模板与产物：以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA（互补DNA）。
  • 后续步骤：在DNA聚合酶催化下合成双链cDNA，与载体重组后克隆，最终获得目的基因的cDNA克隆。

3. cDNA文库构建

  • 关键步骤：
    • 从总RNA中分离mRNA（利用PolyA尾巴）。
    • 通过逆转录合成cDNA，与载体连接后转入受体菌。
  • 特点：cDNA文库中的基因没有内含子，直接对应编码序列。